HOME

국내 시판 중인 고함수 비이온성 특성을 가진 etafilcon A 재질의 투명 투명렌즈, 써클렌즈 및 습윤제(PVP, poly-vinyl pyrrolidone)가 함유된 써클렌즈(Johnson & Johnson사)와 저함수 이온성 특성을 가진 hilafilcon B 재질의 투명렌즈 및 써클렌즈(Baush & Lomb사), 저함수 이온성 특성을 가진 nelfilcon A 재질의 투명렌즈 및 써클렌즈(CIBA Vision사)를 실험 대상으로 하였다(Table 1).

균의 흡착은 ISO 14729를 기준으로 실시하였다. 실험에 사용한 균은 칸디다(Candida albicans, ATCC 1021)이었으며, yeast malt agar(YMA)배지를 사용하여 37^oC의 온도에서 24시간동안 배양하였다. 멸균된 plate에 1.0×1.0⁵ cfu/ml의 균 10 μl를 놓은 후 렌즈의 볼록한 부분을 plate 바닥에 닿게 놓았고, 다시 10 μl의 균을 렌즈 위에 올리고 10분간 흡착시켜 주었다. 균이 흡착된 렌즈를 각각 5 ml의 PBS(phosphate buffer saline, pH7.4)가 담겨있는 12 well plate에서 3번 헹군 후 여과장치 위에 올린 후 12well plate에 있는 멸균 PBS 5 ml를 올려 3분 동안 유지시킨 후 여과시켰다. 여과시킨 렌즈는 새 plate에 볼록한 면이 접촉하도록 올린 후 칸디다균은 YMA 배지를 부어 굳혔다. 1일 뒤 투명 및 써클렌즈에서 자란 균 수를 측정하였다.

인공눈물은 라이소자임 0.18 g, 글로불린 0.18 g, 알부민 0.54 g, 뮤신 0.18 g을 0.01 M 인산완충액(pH 7.4) 100 ml에 녹여 제조하였다.^[28] 오염을 방지하게 위해 인공눈물용액은 membrane filter로 살균 후 사용하였다. 콘택트렌즈가 담긴 튜브에 인공눈물 8 ml를 각각 넣어 진탕기(CR300, FINEPCR, Korea)를 이용하여 50 rpm의 속도로 실온 20^oC에서 24시간 동안 인공눈물 성분을 콘택트렌즈에 침착시켰다. 인공눈물 성분 침착 후 콘택트렌즈는 인산완충액으로 3번 세척 후 인산 완충액을 8 ml만으로 다시 7일, 14일, 28일 동안 인공눈물 침착 조건과 동일한 조건으로 진탕시켰다. 인공눈물에 24시간 동안 침착시킨 렌즈와 인공눈물 침착 후 7일, 14일 및 28일 동안 유지시킨 렌즈를 250 μl의 추출용매(SDS 완충용액:2% sodium dodecyl sulfate, 0.1% dithiothreitol, 0.01 M Tris buffer, pH 8)에 넣은 후 95^oC로 15분간 가열한 후 상온에서 20분 동안 식혀서 단백질을 추출하였다. 단백질을 추출한 후 Lowry 방법을 이용하여 정량하였다.^[29]

콘택트렌즈 표면에 균을 흡착시킨 후 3일 동안 항온항습 조건에서 건조시켜 주사전자현미경(VEGA, TESCAN, Vzech)을 이용하여 5000 배율로 렌즈에 흡착된 균을 확인하였다.

결과는 평균 ±표준편차로 표시하였고 SPSS 12.0 K를 사용하여 분석하였다. 콘택트렌즈 재질과 종류에 따른 균흡착 정도와 써클렌즈의 투명부와 착색부의 흡착정도의 통계적 유의성은 독립표본 t-검정(independent T-test), 인공눈물 침착에 따른 흡착된 균 수는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 유의성을 확인하였으며, p<0.05일 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

투명렌즈에 흡착된 칸디다균은 etafilcon A 재질에서 8.92±3.75 cfu/lens, hilafilcon B 재질에서 7.25±3.21 cfu/lens, nelfilcon A 재질에서 3.93±2.22 cfu/lens이었다. 써클렌즈의 경우 etafilcon A 재질에서 9.21±4.31 cfu/lens, 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질에서 7.70±1.95 cfu/lens, hilafilcon B 재질에서 6.31±3.59 cfu/lens, nelfilcon A 재질에서 3.46±2.43 cfu/lens의 칸디다균이 흡착되었다. 투명렌즈와 써클렌즈 모두에서 etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A순으로 흡착 균 수가 많았다(Fig. 1A),

동일 면적당 흡착 균 수는 투명렌즈의 경우 etafilcon A 재질은 0.056±0.024 cfu/mm², hilafilcon B 재질에서 0.043±0.022 cfu/mm², nelfilcon A 재질에서는 0.026±0.020 cfu/mm² 이었다. 써클렌즈의 경우 etafilcon A 재질은 0.057±0.031 cfu/mm², 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질은 0.093±0.028 cfu/mm², hilafilcon B 재질은 0.049±0.012cfu/mm², nelfilcon A 재질은 0.044 ±0.031 cfu/mm²의 균이 흡착되었다(Fig. 1B).

Fig. 1. 
The colony forming unit of C.albicans on clear and circle soft contact lenses.

A. colony per lens, B. colony per area

써클렌즈의 투명중심부와 착색부에서의 균 흡착 상태를 주사전자현미경을 통해 알아보았다. Etafilcon A 재질의 써클렌즈에서 칸디다균이 투명중심부에 더 많이 흡착되었고(Fig. 2), 습윤제가 함유된 써클렌즈에서도 투명중심부에 더 많이 흡착되었다(Fig. 3). Hilafilcon B 재질의 써클렌즈는 microencapsulation 공법으로 착색한 렌즈이므로 표면에 착색부가 관찰되었으며, 착색부보다 투명중심부에 칸디다균의 흡착이 더 많은 것을 볼 수 있었다(Fig. 4). Nelfilcon A 재질의 써클렌즈 역시 표면의 착색이 관찰되었으며 투명중심부에 칸디다균이 더 많이 흡착된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 2. 
The representative pictures of C. albicans adsorption on non-pigmented and pigmented area of circle contact lenses made of etafilcon A taken by SEM(×5000).

Fig. 3. 
The representative pictures of C. albicans adsorption on non-pigmented and pigmented area of circle contact lenses made of etafilcon A with PVP taken by SEM(×5000).

Fig. 4. 
The representative pictures of C. albicans adsorption on non-pigmented, pigmented and border areas of circle contact lenses made of hilafilcon B taken by SEM(×5000).

Fig. 5. 
The representative pictures of C. albicans adsorption on non-pigmented, pigmented and border areas of circle contact lenses made of nelfilcon A taken by SEM(×5000).

Etafilcon A 재질 써클렌즈는 염료가 내부에 존재하여 표면상으로는 투명부위와 차이가 없었으나 칸디다균의 흡착이 투명부위에 더 많았다. Hilaifllcon B 재질과 nelfilcon A 재질의 써클렌즈는 염료가 외부로 노출되어 있어 투명부와 착색부의 차이가 있음을 확인 할 수 있었다.

써클렌즈를 투명중심부와 착색부분에서의 단위 면적당 칸디다균 수를 비교하였을 때, etafilcon A 재질 써클렌즈의 투명중심부는 0.053±0.037 cfu/mm², 착색부는 0.040±0.026 cfu/mm²이 흡착되었고, 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질 써클렌즈의 투명중심부는 0.050±0.027 cfu/mm², 착색부는 0.028±0.012 cfu/mm²이 흡착되었다. Hilafilcon B 재질의 투명중심부는 0.045±0.043 cfu/mm², 착색부는 0.034±0.032 cfu/mm²이었고, nelfilcon A 재질의 투명중심부는 0.064±0.042 cfu/mm², 착색부는 0.008±0.008 cfu/mm²의 칸디다균이 흡착되었다. Etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A 재질의 써클렌즈에서 착색부에 흡착된 칸디다균 수는 투명중심부의 75.5%, 75.6%, 12.5%에 불과하였다. 또한 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질 써클렌즈의 착색부에 흡착된 균 수는 투명중심부의 56.0%였다(Fig. 6A).

Fig. 6. 
The colony forming number of C. albicans per unit on circle contact lenses.

A. non-pigmented central and pigmented areas

B. non-pigmented central and peripheral areas

써클렌즈의 투명부를 중심부와 렌즈의 가장 바깥쪽인 주변부로 나누어 단위 면적당 칸디다균 수를 비교하였을 때, etafilcon A 재질 써클렌즈의 투명중심부는 0.053±0.037 cfu/mm², 투명주변부는 0.095±0.065 cfu/mm²이 흡착되었고, 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질 써클렌즈의 투명중심부는 0.050±0.027 cfu/mm², 투명주변부는 0.083±0.029 cfu/mm²이 흡착되었다(p<0.05). Hilafilcon B 재질의 투명중심부는 0.045±0.043 cfu/mm², 투명주변부는 0.064±0.041 cfu/mm²이었고, nelfilcon A 재질의 투명중심부는 0.064±0.042 cfu/mm², 투명주변부는 0.057±0.047cfu/mm²의 칸디다균이 흡착되었다(p>0.05). Etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A 재질의 써클렌즈에서 투명중심부에 흡착된 칸디다균 수는 투명주변부의 55.8%, 70.3%, 112.3%에 불과하였다. 또한 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질 써클렌즈의 투명중심부에 흡착된 균 수는 투명주변부의 60.2%였다(Fig. 6B).

인공눈물에 1일 동안 노출시킨 etafilcon A 재질 투명렌즈에 참착된 단백질량은 4732.7±589.1 μg/lens이었으며, 1일 동안 노출 후 PBS에 7일, 14일 및 28일 간 유지시킨 경우 흡착된 단백질 양이 다소 감소하였다. Etafilcon A 재질의 써클렌즈에 침착된 단백질량은 투명렌즈와 큰 차이가 없었으며 습윤제가 함유된 etafilcon A 써클렌즈를 인공눈물에 노출시킨 경우의 단백질량은 습윤제가 함유되지 않은 투명 및 써클렌즈보다 더 많았다. 인공눈물에 1일 동안 노출하였을 때 hilafilcon B 재질 투명렌즈에 침착된 단백질량은 129.6±2.4 μg/lens이었고, 인공눈물 침착 후 7일, 14일 및 28일 동안 PBS에 유지시킨 경우에는 시간이 경과함에 따라 감소하였다. Hilafilcon B 재질 써클렌즈가 1일 동안 인공눈물에 노출되었을 때의 침착 단백질량은 137.7±4.7 μg/lens로 투명렌즈보다 다소 많았으며, PBS에 유지시켰을 경우는 침착된 단백질량이 감소하였다. Nelfilcon A 재질 투명렌즈가 1일 동안 인공눈물에 노출되었을 때의 침착 단백질량은 21.4±6.3 μg/lens이었으며, 인공눈물에 1일 동안 침착 후 7일, 14일 및 28일 동안 PBS에서 유지시킨 경우는 시간이 경과함에 따라 단백질 흡착량이 감소하는 것으로 나타났다. Nelfilcon A 재질 써클렌즈는 1일 동안 인공눈물에 노출되었을 때의 단백질 침착양이 27.7±2.2 μg/lens로 동일 재질의 투명렌즈에 비해 다소 많았으며, 1일 동안 인공눈물에 침착시킨 후 PBS에서 7일, 14일 및 28일 동안 유지시킨 경우는 단백질 침착양이 감소하는 경향을 나타내었으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 7).

Fig. 7. 
The amount of tear protein absorbed on soft contact lenses.

A. clear lens, B. circle lens

눈물 단백질이 침착된 투명 및 써클렌즈에서의 흡착 칸디다균 수 변화를 알아보기 위해 1) 인공눈물에 노출되지 않은 렌즈, 2) 인공눈물에 1일 노출시킨 렌즈, 인공눈물에 1일 노출 후 각각 3) 7일, 4) 14일, 5) 28일 동안 PBS에서 유지시킨 렌즈에서의 칸디다균 수를 비교하였다.

Etafilcon A 재질의 투명렌즈를 인공눈물에 침착시키지 않았을 때는 8.92±3.75 cfu/lens, 1일 침착시킨 경우 4.38±2.70 cfu/lens의 칸디다균이 침착되었으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 28일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아졌다. Hilafilcon B 재질에서는 인공눈물에 침착시키지 않았을 경우 칸디다균의 수는 7.25±3.21 cfu/lens, 1일 침착시킨 경우 3.79±1.62 cfu/lens였으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가할수록 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 14일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아져 etafilcon A 재질보다 눈물단백질의 항균력이 더 짧았다. Nelfilcon A 재질에서는 인공눈물을 침착시키지 않은 투명렌즈의 경우 3.93±2.22 cfu/lens로 흡착 균 수가 가장 적었으며, 1일 침착시킨 경우 2.89±1.78 cfu/lens의 칸디다균이 침착되었으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), hilafilcon A 재질과 마찬가지로 14일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아졌다.

써클렌즈의 경우도 투명렌즈와 비슷한 양상을 보였다. Etafilcon A 재질의 써클렌즈에 흡착된 칸디다균은 인공눈물 침착시키지 않은 경우 9.21±4.31 cfu/lens, 1일 침착시킨 경우 5.04±1.11 cfu/lens로 투명렌즈 보다 칸다다균의 흡착 수가 더 많았으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 14일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아져 투명렌즈보다 눈물단백질의 항균력 유지 효과가 더 적었다. 습윤제가 함유된 etafilcon A 재질의 써클렌즈는 인공눈물을 침착시키지 않은 경우 7.70±1.95 cfu/lens, 1일 인공눈물 침착시킨 경우 5.00±1.78 cfu/lens으로 습윤제가 포함되지 않은 etafilcon A 재질보다 흡착된 칸디다균 수가 더 많았으며. 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 14일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아졌다는 점에서는 습윤제가 포함되지 않은 etafilcon A 재질과 다른 양상을 보였다. Hilafilcon B 재질의 써클렌즈에서 인공눈물 침착 전의 흡착 칸디다 균 수는 6.31±3.59 cfu/lens로 동일 재질 투명렌즈보다 흡착 균 수가 적었으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 28일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아져 투명렌즈보다 눈물단백질의 항균력 유지 효과가 더 컸다. Nelfilcon A 재질 써클렌즈에서는 인공눈물에 침착하지 않은 렌즈는 2.64±2.50 cfu/lens로 동일 재질 투명렌즈보다 흡착 균 수가 적었으며, 1일 침착 후 경과시간이 증가함에 따라 흡착 균 수가 통계적으로 유의하게 증가하였으며(p<0.001), 7일 경과 후에는 인공눈물이 침착되지 않았을 때보다 흡착 균 수가 더 많아져 투명렌즈보다 눈물단백질의 항균력 유지 효과가 더 적었다(Fig. 8).

Fig. 8. 
8. Changes in the colony forming unit of C. albicans on soft contact lens after 1 day-treatment of artificial tear and further incubation in PBS for 7, 14 and 28 days.

A. etafilcon A B. hilafilcon B C. nelfilcon A

칸디다균은 etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A 재질의 순으로 적게 흡착되었다. Onurdağ FK 등^[30]의 FDA I그룹인 polymacon, lotrafilcon 재질, II그룹인 hilafilcon B 재질, IV그룹인 ocufilcon D, etafilcon A 재질에 흡착된 박테리아와 진균의 비교, Imamura Y 등^[31]의 진균인 푸사리움과 칸디다균의 비교 연구에서 FDA I그룹인 galyfilcon A, lotrafilcon A, polymacon 재질, II그룹인 alphafilcon A, III그룹인 balafilcon A, IV그룹인 etafilcon A 재질로 연구한 결과 모든 재질에서 다른 균들에 비해 칸디다균이 더 적게 흡착되었으며, 포도상구균을 대상으로 한 본 연구진의 선행 연구 결과와 비교하여 볼 때^[24] 콘택트렌즈 재질 특성에 따른 흡착 양상은 비슷하였으나 흡착양은 진균인 칸디다균이 더 적은 것을 확인할 수 있었다.

Etafilcon A 재질과 습윤제(PVP)가 함유된 etafilcon A 재질 써클렌즈에서의 균 흡착량을 비교하였을 때 etafilcon A 재질에서 칸디다균의 흡착량이 116.3%로 더 많았다. 칸디다균의 흡착은 etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A 순으로 나타나 재질별 차이가 통계적으로 유의하였다. 포도상구균의 투명 및 써클렌즈의 참착 양상을 연구한 박 등^[24]의 연구에서 포도상구균이 칸디다균에 비해 더 많은 양이 렌즈에 흡착되었으나 etaiflcon A 재질에 포도상구균의 흡착량이 119.4%로 습윤제가 합유된 etafilcon A 재질보다 더 많았으며, etafilcon A, hilafilcon B, nelfilcon A 재질 순의 포도상구균 흡착 양상을 보이는 것으로 나타나 재질에 따른 균의 흡착 양상은 본 연구의 칸디다균과 비슷한 경향을 보였다. Imamura Y 등^[31]의 연구에서도 본 연구와 같이 etafilcon A 재질의 렌즈에 가장 많이 칸디다균과 푸사리움이 흡착이 되며 Simmons RB 등^[32]은 친수성 폴리머에 칸디다균의 흡착은 렌즈 기질의 침투로 이어진다고 보고하였다.

Fleming A,^[33] Leitch EC^[34]이 보고한 라이소자임의 항균력, Tobgi RS 등,^[35] Samaranayake YH 등^[36]의 칸디다균에 대한 항균력이 보고된 것과 같이 본 연구에서도 고함수 이온성인 etafilcon A 재질의 렌즈에 항균 단백질인 라이소자임 및 글로블린이 가장 많이 침착됨으로 인해 흡착된 균 수의 감소 정도가 가장 컸던 것으로 보인다. Fukazawa Y 등^[37]의 연구에서 글로불린이 칸디다균에 대한 항균력을 가진다고 한 것처럼 라이소자임뿐만 아니라 눈물에 포함되어 있는 다른 항균단백질도 영향을 미쳤을 것으로 보인다.

본 연구에서는 콘택트렌즈의 투명 중심부와 착색부, 투명 중심부와 투명 주변부의 칸디다균 흡착을 비교해 보았으며 착색부의 균 흡착이 대부분의 경우 가장 적었으며, 투명 중심부보다 투명 주변부의 균 흡착이 더 많다는 것을 밝혔다. Imamura Y 등^[31]이 균의 생체막이 중심부와 주변부에 따라 차이가 있으며 렌즈디자인과 연관이 있을 것이라고 보고한 바 있으며 본 연구에서도 써클렌즈의 투명부 중 중심부와 주변부의 칸디다균 흡착량이 주변부에서 가장 많은 것으로 나타나 균 흡착이 착색제의 영향보다 디자인의 영향을 더 많이 받는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서 사용한 렌즈의 엣지디자인이 knife edge(infinity edge)design, chisel edge design, round edge design 등 다양하다. 이러한 디자인의 미세한 차이가 칸디다균의 흡착에 영향을 미치는 지에 대해서는 추후 더 연구되어야 할 필요가 있다.

투명렌즈의 표면을 원자현미경(atomic force microscopy)으로 관찰한 결과 hioxifilcon-based, omafilcon A, nelfilcon A, ocufilcon B, senofilcon A, comfilcon A 재질의 표면거칠기와 균 흡착의 상관관계가 있다는 Giraldez MJ 등^[38]의 선행연구가 있었다. 또한, 렌즈의 거칠기는 재질뿐 아니라 써클렌즈의 투명부분과 써클부분에서도 차이가 나는데 이는 균의 흡착에도 영향을 주는 것으로 보고된 바 있다.^[39] 주사전자현미경을 통해 렌즈의 착색방법에 따라 절단면과 표면을 관찰하였을 때 Lorenz 등^[20]은 sandwich 공법으로 만들어진 etafilcon A 재질의 렌즈는 거칠기 측정값인 RMS(root mean square)값이 전면의 착색부는 6±2 nm, 투명부는 5±1 nm로 측정되었으며, embedded 공법으로 명시되어 있는 hilafilcon B 재질은 전면의 착색부는 39±16 nm, 투명부는 11±3 nm으로 착색부와 투명부의 거칠기에 차이가 있었고, 그 외의 렌즈들은 모두 착색부의 거칠기가 투명부보다 높게 나왔으며, 착색제의 위치가 전면부에 가까울 경우 전면부의 투명부, 후면부에 가까울 경우 후면부의 투명부의 거칠기도 높게 나온다고 보고하였다. 반면, Ji 등^[39]은 투명렌즈에서 13.33±1.33 nm, 써클렌즈에서는 64.00±12.93 nm로 투명렌즈와 써클렌즈의 거칠기 차이가 초기 균의 흡착에 영향을 미친다고 보고한바 있다. 본 연구의(주사전자현미경)사진의 결과 sandwich 공법인 etafilcon A 재질의 써클렌즈에서는 착색제로 인한 거칠기가 보이지 않았으며, 반면 embedded 공법이라 명시되어 있지만 착색제로 인한 표면 거칠기가 나타나거나 fully integrated 공법으로 착색된 렌즈 또한 표면의 착색제 분포로 인한 거칠기가 확인된 것으로 보아 착색제로 인한 균의 흡착 등에 영향을 줄 것이라 생각되어진다. 하지만 주사전자현미경을 통하여 균의 흡착을 관찰한 결과 착색부보다 투명부에 균의 흡착량이 더 많았으며, 본 실험결과 값과 동일한 양상으로 보아 표면의 거칠기는 초기의 균 흡착에 영향을 미치지만 진균의 흡착과정을 가역적인 과정, 비가역적인 과정으로 크게 두 가지로 보았을 때 두 번째 단계인 비가역적인 흡착 과정에서 점액성 다당류(exopolymer)를 분비하여 진균과 렌즈표면, 진균과 진균 간의 비가역적인 생물막(biofilm)을 형성한 후에는 거칠기는 균의 흡착에 영향을 적게 미칠 가능성이 있다고 사료된다.^[39] 또한, 동일 재질이지만 습윤제 포함 여부에 따라서 칸디다균의 흡착정도가 달라지는 것으로 보아 단순히 거칠기만이 진균의 흡착에 영향을 미치는 요인은 아닐 것으로 보인다.