청색광에 의한 마우스 망막손상에서 선택적 광수용세포의 사멸

1. 청색광 조사

실험동물은 망막색소상피층에 색소가 존재하는 생쥐(C57black mice, 8주, 수컷, 20-23 g)를 사용하였으며, 모든 동물과 관련된 실험은 건양대학교의 IRB 승인에 따라 시행되었다. Rhodopsin 양을 일정하게 하고 다른 광원의 영향을 최소화하기 위해서 실험군과 대조군 모두(n=24)를 24시간 암순응 시킨 후 산동제인 아트로핀을 2방울씩 점안하였다. 청색광이 망막에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실험군만 463 nm 파장대의 광원을 2800±10 lux 로 6시간 조사하였고, 청색광의 lux와 파장은 IM-1000(TOPCON, Japan)로 측정하였다. 청색광 조사 날을 기준으로 24시간 동안 암순응을 시킨 후, 시간에 따른 망막의 변화를 확인하기 위해 암순응 시킨 날을 포함하여 1일, 3일, 7일째 안구를 적출하였다.

2. 면역염색

산동제만 점안한 대조군과 청색광 조사 후 1일, 3일, 7일이 지난 실험군의 안구를 적출한 후 eye cup상태로 분리하여 4% paraformaldehyde(Wako, Japan)에 24시간 고정하고, 15% sucrose 용액에서 4시간, 30% sucrose 용액에서 overnight하였다. 다음 OCT compound(Sakura, Japan)에 2시간정도 넣어두었다가 포메(embedding) 과정 후 -18°C에서 15 μm로 절편(section)을 만들었다.

절편들은 PBS로 washing하여 OCT compound를 제거하고 4% paraformaldehyde에 20분 고정한 후 0.1% Triton X-100(Sigma, USA)을 처리하여 permeabilization 시켰다. 그리고 PBS로 washing후 1% BSA, 2.5% normal goat serum(Jackson Immunoresearch, USA), 2.5% normal donkey serum(Jackson Immunoresearch, USA)이 들어있는 PBS에 1시간 Blocking 후 Primary antibody인 mouse monoclonal anti-GFAP(1:300, Merck Millipore, Germany), rabbit polyclonal anti-Opsin red/green(1:500, Merck Millipore, Germany), mouse monoclonal anti-Rhodopsin(1:500, Merck Millipore, Germany)를 Blocking buffer에 넣어 4°C에서 shaking하며 overnight 하였다. Secondary antibody (Invitrogen, USA)인 Cy2와 Cy3를 Blocking buffer에 넣어 상온에서 1시간 두고, Hoechst 33258(Sigma, USA)과 PBS를 1:1000으로 만든 용액을 15분 처리하였다. TUNEL assay는 blocking 과정 대신 TUNEL kit(ROCHE, Germany)를 1시간 30분 처리하고 Hoechst 33258 순서부터 위와 동일한 과정으로 진행하였다. 커버글라스로 덮은 뒤 형광현미경(Imager D2, Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하였고, Zen blue edition(Zeiss) 프로그램으로 일정범위의 intensity와 positive-cell 개수를 측정하였다.

3. 단백질 동정

안구를 적출하여 얻은 망막조직을 RIPA lysis buffer(ATTO, Japan)로 분해시켜 PAGE gel에 전기영동 하였고, transfer 과정으로 polyvinylidenedifluoride membrane에 이동시켰다. 이 membrane을 5% skim milk(Duchefa, USA)와 0.05% Tween-20(Georgiachem, USA)이 섞인 PBS 용액에 1시간동안 Blocking 하였다. 5% skim milk에 mouse monoclonal anti-GFAP(1:300, Merck Millipore, Germany), mouse monoclonal anti-phosphorylated ERK1/2(1:1000, Santacruz, USA), rabbit polyclonal anti-ERK1/2(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti-phosphorylated SRC(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti-SRC(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti-phosphorylated c-JUN(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti-c-JUN(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), Actin HRP(1:2000, Santacruz, USA) 등 항체를 각각 처리한 후 4°C에서 overnight 하였다. 그 다음 5% skim milk에 secondary antibody(Invitrogen, USA)를 1시간 처리하여 washing 후 chemi-doc(Bio-Rad, Germany)으로 분석하였다.

4. 통계

본 실험에서의 모든 측정치는 평균±표준편차로 표기하였다. 통계학적 분석은 Microsoft사의 EXCEL 2010버전을 사용하여 t-test함수를 사용하였다.

1. 청색광 조사로 인한 망막의 손상 자극과 망막의 두께 감소

신경아교증(gliosis)은 중추신경에 외상 등으로 손상을 입었을 경우 복구나 손상기전에 관여하여 그 주위에 신경아교세포의 분열 증식이 일어나는 것을 가리킨다. 손상 주위에 증식하는 신경아교세포에는 성상교세포와 미세교세포가 있다. 보통 조직에 상처가 생기면 빈번히 나타나는 것으로, 성상교세포의 표지인자인 GFAP의 증감을 확인하여 조직에 손상자극이 주어졌는지 확인할 수 있다.^[9] 본 연구에서는 마우스를 24시간 동안 암순응 시키고 6시간 동안 2800±10 lux의 청색광을 조사하였다. 청색광으로 인해 망막에 손상자극이 가해지는지 확인하고 시간에 따른 변화를 알아보기 위해 청색광 조사 후 1일, 3일, 7일째 망막의 GFAP 단백질을 면역염색을 하였다. Fig. 1에서 청색광 조사 후 1일째 망막에서 신경절세포층과 속얼기층에 GFAP가 확연히 증가하였고, 시간이 갈수록 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1.

Blue-light promotes retinal gliosis. (A) GFAP expression in mouse retina is shown. Sagittal sections from non-exposed or blue-light exposed retina were immunostained with GFAP antibody. Scale bars are 50 μm. (B) GFAP protein expression was changed in blue-light exposed retina. GFAP protein level was increased at day 1 after blue-light injury, and reduced at day 7. Quantitative analysis of GFAP protein levels is shown in the bottom. Error bars represent the mean±SD of triplicate tests.

GFAP 단백질 증감을 Western blotting을 이용하여 정량적 분석을 한 결과, 대조군을 기준으로 청색광을 조사 후 1일째 망막에서 GFAP 단백질 발현량이 1.44±0.07배 증가했고, 청색광을 조사 후 3일, 7일 째 망막은 대조군과 같은 수준의 GFAP 발현량을 보였다. 이 결과는 망막에서 청색광의 자극은 조사 후 1일째 가장 높다는 것을 보여준다.

세포가 감염되거나 손상을 받은 경우, GFAP의 증가뿐만이 아니라 세포 스스로에 의해 세포사멸(apoptosis)이 일어난다. 이 과정 동안 DNA가 잘라지며, 세포 내 소기관들과 세포질 성분이 조각나게 된다. 세포는 수축되고 갈라져 막으로 둘러싸인 조각으로 나누어지며, 이들은 특수한 식세포에 의해 흡수되고 소화되어 흔적을 남기지 않고 사라지게 된다.^[10] 이를 바탕으로 청색광에 의해서 세포가 손상을 입는지 확인하기 위해 망막의 각 층의 두께를 측정하였다. 24시간 암순응 후 2800±10 lux 를 조사하여 망막의 두께를 확인한 결과, 산동제만 점안한 대조군보다 청색광을 조사한 후 9일째 망막의 두께가 평균적으로 약 28.00±20.60 μm 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2A).

Fig. 2.

Blue-light injury leads to the reduction of retinal thickness. (A) Representative immunostaining images of Hoechst 33258 in blue-light exposed retina and non-exposed retina as control. Scale bars are 500 μm (top) and 100 μm (bottom). (B) Quantitative analysis of retinal thickness in control and blue-light injured retina. Error bars represent the mean±SD of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01.

Fig. 2의 B를 참고하여 전체적인 망막의 두께는 대조군보다 청색광을 조사한 망막의 두께가 평균적으로 28.00±20.60 μm 감소하였고 외핵층은 대조군보다 청색광을 조사한 망막에서 평균적으로 16.00±9.82 μm 감소하였으며 속핵층은 13.00±4.16 μm 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2B). 바깥얼기층과 속얼기층, 신경절세포층은 5.00±2.21 μm 내외의 증감폭을 보였다(n=5, p<0.05). 이 결과는 외핵층에 존재하는 광수용세포의 죽음이 활발히 일어났다는 것을 의미한다.

2. 세포 사멸기전과 관련된 western blotting과 TUNEL assay를 통한 망막 광수용세포의 사멸 확인

광수용세포의 죽음이 세포사멸(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis)에 의한 결과인지를 확인하기 위해 세포사멸기전에 관련한 단백질들인 phosphorylated ERK, JNK, SRC의 변화를 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Blue-light can activates the apoptotic signaling pathways. (A) Western blot analysis showed changes in levels of phosphorylated ERK, SRC, and JUN. At day 1 after blue-light injury, the phosphorylated ERK and SRC was increased, whereas phosphorylated c-JUN was decreased.

청색광 자극을 받은 망막과 그렇지 않은 대조군 망막으로부터 추출한 단백질에서 phosphorylated ERK의 발현을 비교하였을 때 그림에는 없지만 청색광 조사 후 1일째에 phosphorylated ERK가 약 1.89배 증가 하였다. phosphorylated SRC 또한 약 1.59배 증가하였다. 그러나 phosphorylated c-JUN은 반대로 청색광 조사 후 1일째는 미미하지만 약 1.01배 감소하였다. 따라서 청색광에 의한 망막손상은 ERK와 SRC가 포함된 세포사멸 기전과 관련이 있다는 가능성을 제시할 수 있다.

TUNEL 면역염색은 잘라진 DNA조각에 항체가 붙어 형광물질을 발광하게 되는 것으로, 세포사멸의 최종단계라고 할 수 있다.^[10,11] 청색광을 조사 후 1일, 3일, 7일째 망막에 TUNEL 면역염색을 한 결과(Fig. 4A), 대조군에서는 TUNEL로 염색된 세포가 보이지 않지만, 청색광을 조사 후 1일째 망막에서는 오직 외핵층의 광수용세포에서만 TUNEL 면역염색된 세포들이 나타났다.

Fig. 4.

Blue-light promotes the cell death of photoreceptors. (A) TUNEL-positive photoreceptor cells were detectable at day 1 after blue-light injury. Quantitative analysis of TUNEL-positive cells in 150000 μm2 was shown in B. The number of TUNEL-positive cells was significantly increased one day after blue-light injury compared to control. Scale bars represent 100 μm. Error bars represent the mean±SD of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01.

청색광 조사 후 3일, 7일째 망막은 대조군과 비슷하게 TUNEL 면역염색 된 세포들이 감소하였다. TUNEL 면역염색 된 세포들의 수는 청색광 조사 후 1일째 망막만 대조군과 비교하여 215.00±10.02개 증가를 보였다(n=3, P<0.01)(Fig. 4B). 이는 다른 세포가 아닌 광수용세포가 특정적으로 세포사멸이 일어난다는 것을 보여준다.

3. 광수용세포 원뿔세포와 막대세포의 손상 비교

TUNEL을 이용하여 청색광으로 유도된 순수한 광수용세포의 세포사멸을 관찰할 수 있었는데, 이 광수용세포는크게 막대세포와 원뿔세포로 나뉜다. 막대세포는 원뿔세 포보다 빛에 대해 굉장히 민감하지만 주로 명암을 구분하기 때문에 색상을 구분하기는 어렵고, 원뿔세포는 막대세포보다 민감도는 떨어지지만 황반부에서 흡수하는 파장대에 따라 빛의 색상을 구분하여 민감하게 인식할 수 있다.^[7,8] 따라서 청색광 조사 후 원뿔세포와 막대세포 간 세포사멸 차이가 있는지를 밝히고자 하였다. 이를 위해 암순응 24시간 후에 청색광을 2800±10 lux로 조사하여 1일, 3일 7일째 망막에서 원뿔세포의 표지인자인 Opsin 단백질과 막대세포의 표지인자인 Rhodopsin 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역염색 한 후 광수용세포층에서 이들의 intensity를 비교 분석하였다. Opsin 단백질의 발현에서 청색광 조사 후 1일째에서 대조군과 비교하여 intensity가 23.00±5.30% 감소했으며 3일째에서는 미미하게 증가하는 것 같아 보였으나 7일째에서는 대조군과 비교하여 28±7.40%까지 감소한 것을 확인할 수 있었다(n=3, P<0.05)(Fig. 5A, B).

Fig. 5.

Blue-light reduces the opsin expression. (A) Representative immunostaining of Opsin in sagittal sections from blue-light exposed retina and non-exposed retina, counterstained with and Hoechst 33258. Scale bars are 500 μm (top) and 100 μm (bottom). (B) Quantitative analysis of fluorescence intensity in 111000 μm2. The fluorescence signal for opsin was significantly decreased in blue-light exposed retinas compared with that of control. Error bars represent the mean±SD of triplicate tests. *, P<0.05

Rhodopsin 단백질의 intensity에서는 대조군과 비교하여 청색광을 조사한 마우스의 1일째 망막에서 20.00±7.30% 감소하였다(n=3, P<0.05)(Fig. 6A, B). Opsin과 Rhodopsin의 감소량을 비교한 결과 청색광 조사 후 1일까지는 Opsin과 Rhodopsin의 intensity는 큰 차이가 없었지만 3일째에서 Opsin이 약 4.00%, 7일째에서 약 16.00% 만큼 Rhodopsin보다 더 감소하였다(Fig. 6C).

Fig. 6.

Blue-light can lead to selective damage between Opsin- and Rhodopsin-positive cells. (A) Rhodopsin expression in the sections described in Fig. 5A was determined by immunostaining analysis with Rhodopsin antibody. Scale bars are 500 μm (top) and 100 μm (bottom). (B) Quantitative analysis shows the significant decrease in the Rhodopsin fluorescence intensity in blue-light injured retina compared to that of control in 2000000 μm2. (C) Quantification of the fluorescence intensity shows a significant difference in the expression levels between Opsin(black) and Rhodopsin(grey) after blue-light injury. Error bars represent the mean±SD of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01.

이 결과들은 청색광이 광수용세포 중 막대세포보다 원뿔세포에 더 큰 손상을 줄 수 있다는 가능성을 보여준다.

기존 연구에 따르면 청색광으로 유도된 산화스트레스가 망막색소상피층을 악화시켜 부르크막에서 드루젠과 지방 갈색소의 축적이 이루어지는데, 이것이 광수용세포의 세포사멸을 야기한다고 보고하고 있다.^[1,3,6] 연령관련 황반변성의 초기 단계이기도 한 이 과정을 거치면 망막색소상피세포의 사멸 때문에 산화스트레스가 광수용세포까지 영향을 미치게 되므로 광수용세포의 세포사멸을 유도하게 한다고 보고하고 있다.^[3] 그러나 본 연구에서는 망막색소상피세포의 형태 및 분자적 손상은 관찰되지 않았다. 특히, 청색광이 조사된 망막에서 TUNEL 반응 세포는 광수용세포가 존재하는 외핵층에서 유일하게 관찰되었다. 따라서 청색광에 의한 망막손상은 황반변성 유발 기전과는 다른 손상기전이 존재 할 수 있음을 확인하였다. 그리고 세포사멸기전과 관련한 단백질들로 ERK와 SRC 단백질 동정 결과를 보았는데, ERK는 산화스트레스에 의해 인산화가 증가하는 경향을 보이기도 한다.^[3] 이에 따라 기존 연구는 청색광이 산화스트레스를 유도하여 ERK와 SRC가 증가한다고 보고한 바 있다.^[2,3] 본 연구 결과에서도 인산화 된 ERK가 증가한 것으로 보아 빠른 인산화 증가로 인해 면역염색 결과 민감도가 높은 막대세포에 우선 반응한 것으로 볼 수 있다. 그러나 기존 연구처럼 청색광이 산화스트레스를 유발하여 망막색소상피세포 악화의 결과로 광수용세포가 감소한다면 막대세포와 원뿔세포가 균등하게 감소해야 하는데, 전체적인 표를 봤을 때는 Opsin의 양이 Rhodopsin보다 더 감소한 것을 확인할 수 있다. 이 결과는 청색광에 대한 손상 반응이 광수용세포들 사이 제한적인 특정 세포에서 더 잘 일어 날 수 있음을 의미한다.

본 연구에서는 청색광의 유해성을 증명하고 그 기전을 밝히는데 기여하고자 심각한 망막 손상을 야기하도록 실험을 설계하고 진행하였으나, 실생활에 쓰이는 청색광이 사람의 망막에 손상을 줄 수 있다고 정확하게 밝히기 위해서는 일반적인 환경에서 청색광으로 인한 인간 망막 조직 손상을 확인하는 연구가 많이 이루어져야 할 것이다.