콘택트렌즈 다목적용액 적용을 위한 케르세틴과 트랜스-칼콘의 항균 활성

서 론

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 콘택트렌즈 착용과 관련한 대표적인 세균이다.^[1,2] 황색포도상구균의 경우, 주로 정상 피부와 결막을 포함하는 점막 등에 상주하는 균으로 외상으로 손상된 각막에서 흔히 감염을 일으킨다.^[3-5] 또한 다른 포도상구균과는 달리 염증주위에 섬유소막을 형성하여 면역세포로부터 균을 보호하는 혈장응고효소(coagulase)를 생산하며,^[6] 그 외에도 백혈구에 독성 물질인 백혈구 사멸소(lukocidin)과 용혈소(hemolysin) 등을 포함한 감염병 발생에 중요한 많은 단백질을 만들어낸다.^[7] 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 경우, 소프트콘택트렌즈 착용자에게 많이 발생하여 중심성 각막궤양을 유발하는 세균이다. 한국에서 실시한 감염성 각막염에 대한 역학조사에서 가장 많은 비율을 차지하고 있으며,^[2] 인도에서 유통되는 콘택트렌즈 다목적 용액을 대상으로 한 조사에서 가장 흔한 오염균종(55%)이었다.^[8] 이와 같은 두 균주는 세균성 생체막을 형성하여 이들을 제거하기 위해 적용되는 여러 살균제 또는 항생제에 저항하여 그들 스스로를 보호한다.^[9,10]

플라보노이드(flavonoid)는 C₆-C₃-C₆를 기본 골격으로 하는 물질로 식물계에 매우 널리 분포하고 있다. 플라보노이드 화합물은 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 이소플라본(isoflavone), 플라바논(flavanone), 안토시아니딘(antocyanidin) 등으로 분류한다.^[11] 이들의 생리활성에 대한 많은 연구들이 진행되었는데, 항산화 작용,^[12-16] 지질과산화물의 생성 억제 작용,^[14,17] 항암작용,^[15,18] 항염증 작용,^[19-21] 항당뇨 작용^[22] 등이 잘 알려져 있다. 양파에 많이 함유되어 있는 대표적인 플라보노이드인 케르세틴(quercetin)은 양파추출물의 항암 활성,^[23] 항산화 작용,^[23-25] 항균작용,^[24] 항고지혈,^[25] 항염증 작용,^[26] 간보호 효과,^[27] 항진균^[28] 등에 관한 연구를 통해 그 생리 활성이 간접적으로 입증되고 있다. 칼콘(chalcone)은 플라보노이드의 계열인 개환이 된 플라보노이드와 식용 식물에 풍부한 이소플라보노이드의 전구체이다. 이와 같은 칼콘은 그 자체와 유도체들은 약물학적 활성에 있어서 항산화제,^[29,30] 항암,^[31] 항원생동물,^[32] 항균,^[33] 항진균제^[28,33] 등 광범위한 스펙트럼을 가지고 있어서 합성과 생리 활성에 대한 관심이 증가하고 있다. 또한, 트랜스-칼콘(trans-chalcone)은 식물뿌리에서 프로그램된 세포사(cell death)를 유도하고^[34] 허혈성 망막에서 망막혈관생성을 억제하며,^[35] 과산화수소에 의해 유도된 독성으로부터 세포를 보호하는 것으로^[36] 알려져 있다.

콘택트렌즈 착용 및 관리 과정에서 황색포도상구균, 녹농균과 같은 세균과 진균 등에 오염되어 각·결막염, 각막궤양, 안내염과 같은 안질환을 초래할 수 있다. 그리고 각막 대사 작용에도 영향을 미쳐 저산소증,^[37] 각막상피세포의 생존능력 저하,^[38] 각막 장벽기능의 변형^[39] 등을 일으키기도 한다. 이와 같은 콘택트렌즈 사용으로 인해 유발될 수 있는 여러 가지 부작용으로 인해 콘택트렌즈 관리 용품의 엄격한 기준 하에서 관리에 대한 요구가 증대되고 있다. 현재 콘택트렌즈에 침착물 제거와 오염균의 살균을 위해 PHMB, benzalkonium chloride, Polyquaternium 등 다양한 화학 물질들을 콘택트렌즈 다목적용액(contact lens multipurpose solution)에 적용하고 있으나, 이들이 가지고 있는 눈 생리에 미치는 독성 작용도 상당하다.^[40-41] 그러므로 최근 살균 효과를 위해 들어가는 화학 물질을 천연물로 대체 가능한지 알아보기 위한 연구들이 진행되어 왔다.^[42-44]

따라서, 본 연구는 천연물에서 유래한 2종의 플라보노이드를 가지고 콘택트렌즈와 연관된 안질환 발병률이 높은 2종의 균주에 대한 항균활성을 조사하고 이를 기존의 시판되는 콘택트렌즈 다목적 용액에 적용 가능성에 대한 기초자료를 얻고자 한다.

대상 및 방법

1. 시약

플라보노드계인 케르세틴(quercetin hydrate)과 트랜스-칼콘(trans-chalcone)을 Sigma-Aldrich에서 구입하여 항균활성 시험에 사용하였다. 케르세틴은 DMSO에, 트랜스-칼콘은 EtOH에 녹여 10 mg/ml 농도가 되도록 각각 준비한 후, syringe filter(0.22 μm)를 사용하여 여과한 후 사용하였다.

Fig. 1.

Molecular structure of Quercetin hydrate.

Fig. 2.

Molecular structure of trans-Chalcone.

결과 및 고찰

1. 항균활성 평가

시험균주 2종에 대해 케르세틴과 트랜스-칼콘의 항균활성을 paper disc diffusion method으로 측정한 결과는 Table 1과 같다. 각 균주 배양 시간인 24시간 배양한 후 disc 주변에 생육저지환이 생기면 항균 활성을 갖는 것으로 판정하였다. 실험에 사용한 2종의 시료인 케르세틴과 트랜스-칼콘은 S. aureus에 대해 둘 다 생육저지환이 형성된 반면, P. aeruginosa에 대해서는 모두 생육저지환이 관찰되지 않았다.

Table 1.

Antibacterial activities of Quercetin and trans-Chalcone

2. 최소저해농도(MIC) 평가

Paper disc diffusion은 케르세틴과 트랜스-칼콘의 항균활성 여부를 확인할 수 있지만, 확산 정도에 따라 같은 시료에 대한 활성이 상이하게 나타난다. 최소저해농도(MIC)는 미생물의 성장을 억제하는 항생물질의 최소농도로 MIC 값이 낮을수록 시료물질의 감수성은 높다고 할 수 있다. IC₉₀, IC₅₀은 각각 균의 생성을 90%, 50% 억제하는 농도를 의미한다. 항균 활성이 있는 균주인 S. aureus에 대한 MIC를 실시한 결과는 Fig. 3, 4와 같다. MIC의 농도가 낮을수록 미생물 생육 저해력이 높은 것으로, 즉 높은 농도에서 생육이 저해되면 항균활성이 상대적으로 낮은 것으로 평가하였다. 케르세틴의 MIC 값은 250 μg/ml, 트랜스-칼콘의 MIC 값은 62.6 μg/ml으로 측정되었으며, 이를 통해 계산한 케르세틴의 IC₉₀은 149 μg/ml, IC₅₀은 31.0 μg/ml이었으며, 트랜스-칼콘은 IC₉₀은 15.2 μg/ml, IC₅₀은 8.9 μg/ml였다.

Fig. 3.

Minimum inhibitory concentration of quercetin against S. aureus.

Fig. 4.

Minimum inhibitory concentration of trans-chalcone against S. aureus.

3. 최소사멸농도(MBC, minimum bactericidal concentration) 평가

낮은 시료 농도에서 MIC 값이 나왔다고 해서 그 농도에서 균이 모두 사멸하였다고 생각할 수 없으며, 이는 시료의 영향으로 균의 성장하지 않아 죽은 것처럼 보일 수 있기 때문에 MIC 값이 나타난 그 이상의 농도의 시료 배양액들을 하드배지(1.5% agar)에 처리하여 colony를 형성하지 않는 농도를 찾고자 하였다. 케르세틴과 트랜스-칼콘의 S. aureus에 대한 MBC 검사를 실시한 결과는 Fig. 5, 6과 같다.

Fig. 5.

Minimum bactericidal concentration of quercetin against S. aureus. A: 250 μg/ml quercetin, B: 500 μg/ml quercetin, C: 1,000 μg/ml quercetin.

Fig. 6.

Minimum bactericidal concentration of trans-chalcone against S. aureus. A: 62.5 μg/ml trans-chalcone, B: 125 μg/ml trans-chalcone, C: 250 μg/ml trans-chalcone, D: 500 μg/ml trans-chalcone, E: 1,000 μg/ml trans-chalcone.

케르세틴의 MIC 값이 250 μg/ml이었으므로 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1,000 μg/ml에 대해 colony 형성을 관찰하였다. MBC를 진행한 모든 농도에서 균이 자라는 것을 24시간 배양 후 확인하였다(MBC: 1,000<). 트랜스-칼콘은 MIC 값이 62.6 μg/ml이었으며, 따라서 이를 기준으로 MBC를 진행한 결과 62.5 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1,000 μg/ml으로 농도가 증가할수록 형성된 colony 수가 적었다. 그러나 1,000 μg/ml 농도에서 colony가 관찰되는 것으로 보아 S. aureus에 대해 저해는 하나, 사멸까지는 아닌 것으로 판단된다(MBC: N. D.).

4. 황색포도상구균과 녹농균에 대한 콘택트렌즈 다목적 용액의 살균력

콘택트렌즈 사용과 관련 있는 균주인 황색포도상구균과 녹농균에 대해 항균활성을 가진 시료를 더욱 효과적으로 콘택트렌즈 다목적용액에 적용하기 위하여 다목적용액의 항균 활성을 비교분석하였다. 현재 시판중인 국내·외 6개 제조사의 다목적용액의 최소 권장시간 동안 각각 처리한 후 살균력을 비교 실험하였다. 실험에 사용한 콘택트렌즈 다목적용액에서 살균 작용을 하는 것으로 알려진 주요 성분과 권장 처리시간을 Table 3에서 정리하였다.

Table 3.

Compositions of MPSs studied

식약처 가이드라인^[45]에 따른 MPS의 두 균주에 대한 살균력을 측정하였다. colony 수를 셀 수 있는 경우는 colony counting하고 colony 수가 너무 많아 셀 수 없는 경우는 육안으로 보고 직관적으로 판단하였다. S. aureus에 대해서는 E(60개) < D(117개) < B(132개) < C≒F < A 순으로, P. aeruginosa에 대해서는 E(32개) < A(197개) < D(298개) < C(409개) < B < F 순으로 colony 수가 증가하였다(Fig. 7, 8). E사 제품은 gram-positive인 S. aureus에도 효과가 있으며, gram-negative인 P. aeruginosa에도 효과가 있는 양자의 세균 모두에 살균력이 가장 좋다는 것을 확인할 수 있었다. 반면, A사 제품은 gram-negative인 P. aeruginosa에는 효과가 좋으나, gram-positive인 S. aureus에 대한 살균력은 효능이 낮음을 알 수 있다. 또한, F사 제품의 경우, S. aureus와 P. aeruginosa 모두에 대해 검사한 MPS들 중 가장 살균력이 좋지 않은 제품이라고 할 수 있겠다. F의 경우는 콘택트렌즈 관련 세균과 진균에 대한 살균 효과가 여러 선행 연구^[46,47]에서 검증된 0.0001%의 PHMB를 주된 성분으로 사용하고 있었다. 그럼에도 불구하고, 본 연구에서는 S. aureus와 P. aeruginosa에 대해 활성이 가장 낮은 것으로 조사되었다. 이는 제품에 들어 있는 다른 화학성분들과 상호작용을 통해 살균력이 저하된 것으로 사료된다. 따라서 추후 이러한 MPS에 포함되는 다른 화학 물질들과의 상호관계에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 7.

Antibacterial activities of MPSs against S. aureus.

Fig. 8.

Antibacterial activities of MPSs against P. aeruginosa.

5. 활성이 약한 다목적용액(MPS)에 첨가한 트랜스-칼콘의 항균활성

항균활성 검사에서 사용된 MPS들 중에 실험에 사용한 두 균주 모두에 살균력이 약한 것으로 조사된 F사의 MPS를 선정하여 S. aureus에 항균활성이 있는 트랜스-칼콘을 첨가하여 MPS의 살균제로서의 적용 가능성을 확인하고자 하였다. MIC 검사에서 측정한 트랜스-칼콘의 IC₉₀에 해당하는 15.2 μg/ml를 100%로 하여, 75%(11.4 μg/ml), 50%(7.6 μg/ml), 10%(1.52 μg/ml) 농도로 F사의 MPS 원액에 첨가하여 항균활성을 검사하였다. 항균활성 검사는 식약처의 콘택트렌즈 가이드라인^[45]을 따라 실시하였으며 트랜스-칼콘을 첨가한 MPS 용액에 6시간 동안 S. aureus를 처리하였다.

10%와 50% 농도에서는 대조군보다 오히려 균이 더 증식하여 colony 수를 셀 수 없을 정도로 균이 자랐으나, 75% 농도부터는 colony를 확인할 수 없었다(Fig. 9). 즉, 일정농도 이상의 트랜스-칼콘은 기존 다목적용액에 들어있는 살균 성분인 PHMB의 기능을 저해하지 않고 PHMB 단독으로 사용하는 것보다 항균 활성이 향상된다는 것을 의미한다. 이는 트랜스-칼콘이 콘택트렌즈와 관련 있는 S. aureus을 사멸시키는 항균제로의 가능성을 제시한다. 그러나 낮은 농도로 트랜스-칼콘을 처리하였을 때 MPS만 사용한 대조군에 비해 더 많은 colony 수가 관찰된 이유를 명확하게 확인할 수 없다. 그러나 콘택트렌즈 관리용품에서 살균이란 세균을 완전 제거하는 것이 아니라, 유해한 균수를 일정수준 이하로 낮추는 것^[45]이기에, 이에 트랜스-칼콘을 기존 다목적용액에 적용하여 항균활성을 기대할 수 있는 최저 농도인 11.4 μg/ml에서 항균활성을 기대할 수 있다. 따라서 기존 시판되고 있는 MPS에 적용하거나 녹농균과 세라티아균 같은 콘택트렌즈와 관련이 있는 다른 균주들에 항균 활성이 있는 천연 유래물질을 탐색하고 이들과의 상호 작용에 관한 연구를 진행하면 의미가 있을 것으로 생각된다.

Fig. 9.

Antibacterial activities of trans-Chalcone with MPS of F Company.

이처럼 우리는 이번 연구에서 플라보노이드계 화합물인 케르세틴과 트랜스-칼콘의 콘택트렌즈 관련 세균에 대한 항균 활성을 확인하였다. 그리고 MIC 값이 낮은 트랜스-칼콘을 활성이 약한 콘택트렌즈 다목적용액에 첨가하였을 때 일정 농도 이상에서 항균활성이 관찰되어 새로운 살균제로서의 가능성을 발견하였다.

그러나, 본 연구에서의 한계점은 트랜스-칼콘이 grampositive균과 gram-negative 균 모두에 활성을 가지지 않고 gram-positive 균에 대해서만 항균활성을 보인다는 것이다. 다목적용액의 살균제에 요구되는 사항 중 하나가 grampositive균, gram-negative 균, 그리고 진균까지 넓은 스펙트럼의 항균활성이다. 또한, 이번 연구에 사용한 다목적용액의 경우 함유된 각 성분들의 조성과 비율을 제조사에서 정확히 알려주지 않아 다목적용액과 일정 농도 이상의 트랜스-칼콘을 함께 사용하였을 때 활성이 증가한 것으로 나타났으나, 다른 조성비를 가진 다목적용액에서는 어떻게 작용할지 모른다는 것이다. 따라서 이 부분에 대한 연구들이 추후 진행되어야 하며, 또한 콘택트렌즈와 관련된 세균과 진균에 대해 폭넓은 살균력을 가진 또 다른 천연물질의 탐색도 계속되어야 할 것으로 생각된다.

결 론

케르세틴과 트랜스-칼콘이 콘택트렌즈 관련한 안질환 유발 세균 중 하나인 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타내었으며, 특히 트랜스-칼콘의 항균활성이 케르세틴보다 9.8배(IC₉₀ 기준) 더 높았다. 실험에 사용한 다목적용액 중 항균 활성이 가장 낮은 F사 제품에 트랜스-칼콘을 IC₉₀ 농도를 기준으로 트랜스-칼콘과의 시너지 효과를 확인한 결과, IC₉₀의 75%에 해당하는 농도에서부터 항균활성을 보였다. 따라서 본 연구는 플라보노이드계 화합물인 케르세틴과 트랜스 칼콘을 항균물질로 적용한 콘택트렌즈 다목적용액의 개발 가능성을 제시한다.

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