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본 연구에 사용된 콘택트렌즈는 국내에 시판되고 있는 소프트렌즈 중 etafilcon A 재질인 렌즈와 hilafilcon B 재질인 렌즈였다(Table 1). Etafilcon A 재질은 FDA 기준 group IV에 해당하여 고함수/이온성이고 hilafilcon B 재질은 FDA 기준 group II에 해당하여 고함수/비이온성이다. 두 재질의 함수율은 각각 58%, 59%로 비슷하였으며, 기본 monomer가 HEMA소재로 되어있는 렌즈로 도수는 −3D로 일정하였다.^[15] 본 연구에서 선택한 2종의 콘택트렌즈는 함수율이 유사한 렌즈이나 이온성 여부가 다른 렌즈로 이온성 여부에 의한 단백질 침착량 및 침착되는 단백질 종류의 차이에 의한 산소투과도의 변화 차이를 알아보기 위해 선정되었다.

알부민(bovine serum albumin, Amresco Co., USA)용액은 눈물 조성과 동일한 0.54 g/100 ml의 농도로 제조하였으며 라이소자임(lysozyme EGG white, Amresco Co., USA) 용액은 0.18 g/100 ml, 글로불린(γ-globulins from bovine blood, Sigma, USA) 용액은 0.18 g/100 ml의 농도로 제조하였으며 눈물 단백질 용액은 이 3종의 단백질이 모두 포함되도록 제조하였다.^[16] 비슷한 단백질 양이 침착되었을 때의 산소투과도를 비교하기 위해 렌즈 재질에 따른 단백질 침착량을 고려하여 단백질 침착량이 많으며 일일착용렌즈인 etafilcon A 재질은 2분, 5분, 20분, 40분, 1시간, 6시간, 12시간 동안 노출시켰으며, 단백질 침착량이 적으며 2주 착용렌즈인 hilafilcon B 재질은 3, 7, 14일 동안 인공누액에 노출시켰다. 눈물 단백질 용액, 라이소자임 용액, 알부민 용액 또는 글로불린 용액이 5 ml씩 들어있는 바이알에 소프트렌즈를 넣은 후 진탕기(shaker, CR300, FINEPCR, Korea)를 이용하여 단백질을 침착시켰다(50 rpm). 소프트렌즈에 침착된 단백질은 250 μl의 추출용매(SDS 완충용액: 2% sodium dodecyl sulfate, 0.1% dithiothreitol, 0.01 M Tris buffer, pH 8)에 넣고 95^oC로 15분간 가열한 후 상온에서 20분 동안 식혀서 추출하였으며, Lowry 방법을 이용하여 정량하였다.^[17]

산소투과도는 polarographic 방법으로 측정하였다.^[15] 0.9% 식염수에 담긴 콘택트렌즈와 polarographic cell, cell mounting fixture를 항온항습기(WTH-E 155, Wisecube, Korea, 습도 95%, 온도 35^oC)에 넣고 6시간 이상 평형 상태를 유지시킨 후 polarographic cell 위에 식염수 15 μl를 떨어뜨리고 수분을 제거한 렌즈를 올려놓았다. 렌즈는 nylon mesh를 씌운 cell mounting fixture로 고정하였고 permeometer(Model 201T O₂ permeometer, CHREATECH, USA)를 이용하여 전류값을 측정했다. 렌즈의 중심두께는 electronic thickness gauge(Model ET-3, CHREATECH, USA)를 이용하여 측정하였다. 동일한 재질의 렌즈 전류값은 4번씩 반복 측정하였고, 모든 방법은 국제 표준화 기구인 ISO(International Organization for Standardization)의 기준에 따랐다.

모든 측정값은 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험결과 간의 유의차 분석은 일원분산분석(one-way ANOVA)를 실시하여 p<0.05일 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

Etafilcon A 렌즈를 12시간동안 단백질 용액에 노출시켰을 때의 단백질 침착량은 라이소자임 용액에 노출시켰을 때는 2599.5 μg/lens, 알부민 용액에서는 67.5 μg/lens, 글로불린 용액에서는 91.5 μg/lens였고 hilafilcon B 렌즈를 14일 동안 단백질 용액에 노출했을 때의 단백질 침착량은 라이소자임은 20.7 μg/lens, 알부민은 21.9 μg/lens, 글로불린은 24.4 μg/lens였다(Fig. 1). Etafilcon A의 단백질 종류별간에 단백질 양 차이에서 3가지 단백질 간은 통계적으로 유의한 차이를 보였고(p=0.000), 두 단백질 간의 비교에서는 lysozyme과 albumin(p = 0.000), lysozyme과 globulin(p = 0.000)은 통계적으로 유의한 단백질 침착량의 차이를 보였으며, albumin과 globulin은 통계적으로 유의하지 않았다(p = 0.978). Hilafilcon B의 경우 3가지 단백질 간 유의한 차이는 없었고(p = 0.727), 두 단백질 간의 비교에서도 유의한 차이를 보이지 않았다(lysozyme-albumin; p = 0.983, lysozyme-globulin; p = 0.717, albumin-globulin; p = 0.812).

Fig. 1. 
Amount of protein deposited on etafilcon A lenses according to protein type.

Etafilcon A 렌즈의 경우는 (−)로 하전된 이온성 렌즈이므로 (+)로 하전된 라이소자임의 침착이 월등하게 많았으며, (−)로 하전된 알부민 및 글로불린의 흡착량은 라이소자임에 비해 크게 적었으며 (−) 하전량이 더 큰 알부민의 흡착량이 가장 적었다. Hilafilcon B 렌즈의 경우는 이온성 여부가 다른 두 렌즈간의 단백질 흡착량이 크게 차이가 나는 것으로 보아 소프트렌즈의 이온성과 단백질 침착량과의 상관성을 확인할 수 있었다. 또한, hilafilcon B 렌즈의 경우는 라이소자임, 알부민, 글로불린의 침착량이 거의 비슷하여 단백질의 종류에 따른 침착량의 차이는 크지 않았다. 각 단일 단백질 성분이 함유된 용액간의 단백질 침착량 차이가 크지 않은 것은 소프트렌즈에 단백질 성분이 부착될 수 있는 공간이 한정적이기 때문에 각 단백질의 침착이 경쟁적으로 일어나서 나타나는 결과라고 생각된다.

인공눈물 단백질이 침착되지 않은 etafilcon A의 산소투과도는 20.2×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)이었으며, 라이소자임의 침착량이 증가할수록 산소투과도는 감소하여 2분 동안 라이소자임 용액에 노출시켰을 때 697.0 μg/lens의 라이소자임이 침착되었으며 이 때 산소투과도는 19.2×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)였으며, 6시간 노출되었을 때는 2242.2 μg/lens의 단백질이 침착되었고 산소투과도는 16.7×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)로 라이소자임이 침착되기 전의 82.7%였으며, 12시간동안 노출되었을 때에는 2599.5 μg/lens의 단백질이 침착되었고 산소투과도는 16.1×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)로 침착되기 전의 80.1%의 산소투과도를 가지는 것으로 나타났다. 침착된 라이소자임 양에 따른 산소투과도의 변화는 상관계수 0.9613으로 강한 상관관계를 가지고 있었다(Fig. 2A).

Fig. 2. 
The measured Dk/t according to amount of protein deposited on etafilcon A lens.

A. lysozyme, B. albumin, C. globulin

알부민의 경우는 12시간 동안 노출되었을 때에 침착량이 67.5 μg/lens였고 산소투과도는 19.9×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)로 단백질량이 증가함에 따라 산소투과도가 감소하는 경향을 보였으나 변화 정도는 크지 않아 알부민이 침착되기 전의 98.4%였다. 침착된 알부민 양에 따른 산소투과도의 변화는 상관계수 0.2949로 약한 상관관계를 보였다(Fig. 2B).

글로불린의 경우는 12시간 동안 노출되었을 때에 최대 침착 글로불린 양이 91.5 μg/lens였고 산소투과도는 18.9×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)로 단백질량이 증가함에 따라 산소투과도가 감소하는 경향을 보였다. 변화 정도는 글로불린이 침착되기 전의 93.6%로 라이소자임에 비해 변화 정도가 크지 않았으나 알부민에 비해서는 다소 큰 감소를 보였다. 침착된 글로불린 양에 따른 산소투과도의 변화는 상관계수 0.8495로 강한 상관관계를 가지고 있었다(Fig. 2C).

눈물 단백질의 침착에 의한 산소투과도의 감소 정도가 라이소자임, 알부민 및 글로불린의 양이 증가함에 따라 더 커지는 것으로 보아 침착되는 단백질량과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 그러나 단백질량 외에도 소프트렌즈와 개별 단백질 간의 상호 작용에 의해서도 산소투과도의 변화가 초래될 수 있을 것으로 생각되어 동일한 양의 단백질 침착이 되었을 때의 산소투과도 변화가 단백질의 종류에 따라 달라지는 지에 대해 알아 볼 필요가 있다. 이에 단백질 침착량과 산소투과도 변화의 추세선 식을 이용하여 라이소자임, 알부민, 글로불린의 산소투과도를 예측하여 보았다. 라이소자임의 경우는 침착량이 다른 단백질의 100배 이상이 되므로 산소투과도에 더 크게 영향을 미치는 것처럼 나타났으나 실제로 동일한 양이 침착되었을 때에는 알부민과 글로불린이 산소투과도에 미치는 영향이 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 3) 따라서 침착된 단백질량 뿐만 아니라 단백질의 종류도 산소투과도에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

Fig. 3. 
The calibrated Dk/t according to amount of protein deposited on etafilcon A lens.

인공눈물 단백질이 침착되지 않은 hilafilcon B의 산소투과도는 19.2×10⁻⁹(cm/sec)(mlO₂/ml×mmHg)이었으며, 라이소자임의 침착량에 따른 산소투과도의 변화 정도는 크지 않아 14일 동안 라이소자임 용액에 노출되었을 때 20.7 μg/lens 이 침착되었으며 산소투과도도 침착 전의 99.6%로 큰 차이가 없었다(Fig. 4A). 알부민의 경우는 14일 동안 노출되었을 때에 침착량이 21.9 μg/lens 로 침착량이 적었고, 산소투과도 역시 알부민 침착 전의 100.8%로 변화가 없었다(Fig. 4B). 글로불린의 경우는 14일 동안 노출되었을 때에 침착량이 24.4 μg/lens였고 산소투과도는 침착 전의 96.1%로 다른 단백질에 비해 감소되는 정도가 상대적으로 컸으며 상관계수도 0.5235로 단백질 침착량과 산소투과도의 감소가 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Fig. 4C).

Fig. 4. 
The measured Dk/t according to amount of protein deposited on hilafilcon B lens.

A. lysozyme, B. albumin, C. globulin

본 연구에서는 etafilcon A와 hilafilcon B 렌즈에 침착된 단백질량과 산소투과도의 관계를 알아보았다. 이 등은^[9] 눈물 단백질 용액에 의해 소프트렌즈의 산소투과도가 감소하며 감소하는 정도가 소프트렌즈 재질에 따라 다르다고 보고한 바 있으나 그러한 결과가 나온 원인에 대해서는 추후 보완 연구가 필요하다고 하였다. 본 연구에서는 이러한 소프트렌즈 재질에 따른 산소투과도의 변화 차이가 렌즈에 침착되는 단백질의 양 및 종류와 관련이 있는지를 알아보았다.

콘택트렌즈의 단백질 침착은 주로 눈물로부터 유래하며 침착시간이 경과됨에 따라 침착된 단백질은 변성되며 반투명해진다.^[18,19] 단백질은 주로 소프트렌즈의 표면에 침착되지만 고함수 렌즈들은 렌즈를 관통하여 렌즈의 pore에 침착되게 된다. 하이드로겔 렌즈에서 단백질 침투는 pore size, polymer chain의 농도, 단백질 구조, 단백질 크기에 따라 달라지는데 알부민은 유연한 단백질이라서 구조가 쉽게 변하고 하트모양의 구조로 되어있으며 분자량이 66.4 kD, 크기는 약 80×80×80 Å이다.^[20] 라이소자임은 약간 작은 타원형 형태로 129개의 아미노산으로 이루어져 있으며 분자량은 14.3 kDa이고 약 45×30×30 Å의 크기를 가지고 있다.^[21] 글로불린은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE가 있고 분자량이 100~500 kDa로 다양하며 비교적 큰 단백질이다.^[22,23] 많은 연구에서 콘택트렌즈 재질의 pore 크기가 100 Å 이하라고 보고되고 있다.^[24]

Etafilcon A 재질의 경우 라이소자임은 침착량이 다른 단백질의 100배 이상이 되었으며, 단백질 용액에 동일 시간 동안 노출되었을 때 라이소자임 용액에 노출된 etafilcon A 렌즈의 산소투과도가 가장 크게 감소하였다. 즉, 산소투과도는 단백질의 침착량과 비례하여 감소하게 되는데, 라이소자임 침착량이 알부민이나 글로불린에 비해 월등하게 많기 때문에 동일 시간동안 인공눈물에 노출되었을 때에는 라이소자임에 의한 산소투과도의 감소가 가장 크게 나타났다. 그러나 동일한 양이 침착되었을 때는 오히려 산소투과도에 미치는 알부민 및 글로불린이 라이소자임보다 산소투과도에 더 큰 영향을 미치며, 글로불린이 가장 큰 영향력이 가진 것으로 나타났다. 이는 라이소자임과는 다른 표면 전하를 가진 알부민 및 글로불린이 소프트렌즈의 표면에서 라이소자임과는 다른 상호작용을 유발하여 산소투과도에 영향을 미치기 때문인 사료된다.

Hilafilcon B 렌즈의 경우에는 라이소자임, 알부민 및 글로불린의 침착된 단백질량 차이가 크지 않았다. Etafilcon A와 같이 methacrylic acid가 공중합된 렌즈는 methacrylic acid에 의해 렌즈의 pore 크기가 증가되는 것으로 알려져 있으나, hilafilcon B 렌즈는 methacrylic acid가 함유되어 있지 않은 일반적인 polyHEMA 소재의 하이드로겔 렌즈로 작은 pore 크기 때문에 알부민이나 글로불린과 같은 단백질의 내부 침착이 크게 감소하게 된다.^[20] 또한 비이온성이기 때문에 라이소자임의 침착량이 etafilcon A 렌즈와 크게 차이가 나게 되어 etafilcon A 렌즈 보다 단백질 침착에 의한 산소투과도의 변화가 크지 않은 것으로 보인다. 그러나 hilafilcon B 렌즈에서 비록 산소투과도의 감소가 크지 않았지만 글로불린의 경우는 단백질 침착량과 산소투과도의 감소가 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 즉, 같은 양의 단백질이 침착되었을 때 etafilcon A 렌즈에서와 마찬가지로 hilafilcon B 렌즈에서도 글로불린이 산소투과도에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

분자량이 큰 단백질인 글로불린은 라이소자임과 알부민에 비해 pore를 통과하지 못하고 렌즈 표면에 침착되면서 pore를 막아 눈물(산소가 용해되어 있는)의 이동을 방해할 수 있다. 또한, 렌즈 표면에 침착된 큰 크기의 단백질이 눈물의 순환 시에도 잘 제거되지 못하고 침착된 시간이 경과됨에 따라 단백질 변성으로 이어지게 되면 변성된 단백질이 원래 가지고 있던 친수성의 성질을 잃고 소수성의 성질로 바뀌면서 눈물에 용해되는 산소의 양이 순차적으로 감소하는 결과를 초래할 것으로 보인다.^[25] 이 등^[26]은 소프트렌즈의 산소투과도에 pH 및 삼투압이 영향을 미친다고 하였으며 미세한 눈물 환경의 차이에 따라 산소투과도가 달라질 수 있음을 보고한 바 있다. 따라서 일정 시간 동안 착용한 소프트렌즈의 산소투과도는 주변 환경의 변화뿐만 아니라 침착된 단백질의 양 및 종류에 따라 달라져 제조사에서 제시하고 있는 산소투과도와 다를 것으로 보인다.